luda 首先，不显示Ct值(信号)
1.反应周期数不足。通常应该有35个以上的循环。根据实验情况，可以增加循环，但45个以上的循环会增加太多的背景信号。
2.检测荧光信号的步骤不正确。通常在72延长时收集荧光，Taqman方法通常在退火结束或延长结束时收集信号。
3、引物或探针分解：可通过页面电泳检测完整性。
4、探针设计不好：设计探针温度低于引物，探针不杂交，产品扩大。
5、模板量少：未知浓度的样品应从系列稀释样品的最大浓度开始。6.模板分解：防止样品制备中杂质的引入和模板重复冻融的发生。
第二，如何确认模板是否包含PCR反应电阻材料？
有时，RNA或cDNA模板中有对逆转录和荧光PCR反应的抵抗物质。为了确认是否存在这种抵抗物质，可以使用高浓度的模板稀释到3-4个梯度，进行荧光定量PCR反应。如果存在不受干扰的有害物质，得到的Ct值会随着模板浓度的变化而变化。而且，如果模板中存在抵抗物质，实验过程中会发现高浓度模板反应性能下降的现象。第三，Ct值出现得太晚了
1.反应条件不好：为了达到最佳反应条件，重新设计讲义或探针，适当降低退火温度，增加镁离子浓度等。
2、PCR多种反应成分分解或样品添加不足；3、扩增产物片段过长：一般采用100-200B P的扩增长度。
第四，标准曲线的线性关系不好
1、加样品误差，标准产品稀释不是梯度；2、标准产品分解：标准产品尽力避免重复冻融。3、引物或探针不好：重新设计；
4、模板有抑制剂，或者模板浓度太高。第五，阴性对照组也明显增加
1、荧光PCR mix或水被污染。
2、引物二聚体的出现：35个周期后，阴性对照组的扩增情况正常，可与溶解曲线一起分析。
3、反应过程中探针分解：页面电泳检测探针；
第六，溶解曲线有一个或多个主要峰值。
1、底漆设计不好：避免异合体和发夹结构的出现。
2、底漆浓度不好：适当调整底漆浓度；
3、低退火温度：提高退火温度。
4、镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度。5.模板中基因组的污染：在RNA提取过程中避免基因组DNA污染，或通过讲义设计避免非特异性扩增。
七、荧光定量PCR中如何避免基因组DNA扩增？
1、引物设计，避免基因组DNA扩增；
2.在RNA提取过程中，利用DNASEI去除RNA中混合的基因组DNA。
八、放大效率低
1、反应试剂成分，特别是荧光染料分解；
2、反应条件不好：适当降低退火温度或改为三级放大法。
3.反应系统中有抑制物。通常在模板中引入，因此必须先适当稀释模板，然后将其添加到系统中，以减少抑制物的影响。
第九，重复性不好
1、样品不准确；
2、仪器差异样品温度条件差，温度均匀性差；
3.模板浓度低：样品的初始浓度越低，重复性越差，因此需要减少样品的稀释倍数。
10.增强曲线不正常，一进入指数期间，马上进入平台期间，向右弯曲
1、基线等设置不当：按照设备说明书重新操作；
2、模板量太大：放大曲线在10个周期内达到峰值时，模板要稀释100-1000倍后使用。
11.由于各孔之间的荧光信号如何校准、进一步操作的误差、离心管投光性能的差异、荧光激发效率的差异等偶然误差是不可避免的，因此仪器收集的原始信号必须进行归一化校准，以消除对定量结果的影响。这种校准可以通过在反应系统中添加荧光染料来完成，通常使用称为阳性基准信号的红色ROX荧光。ROX的反应缓冲液浓度是固定的，因此该信号的强度与反应系统的总体积和总荧光激发效率呈正相关。ROX校正提高了定量数据的准确性和再现性，减少了孔之间的差异。12.荧光定量PCR CT值一般认为多少次模板没有放大？如果进入日志期的周期数大于35，则RealTime RT-PCR检查无效，基因不表达。当进入代数的循环数为32-35个循环时，至少需要3个迭代来判断是否能检测基因的表达。