鲁达 QsRNA-seq：一种用于对小RNA进行高通量鉴别和定量的方法
QsRNA-seq: a method for high-throughput
profiling and quantifying small RNAs
该篇文章主要介绍了如何分离长度很短的小RNA分子，然后如何利用该分离方法得到的小RNA分子进行建库操作。最后从技术重复性，生物学重复性，小RNA检测能力等方面对QsRNA-seq方法进行评估。
摘要
利用高通量测序技术进行小非编码RNA定量非常困难，因为这些RNA长度太短。研究人员开发了一种名为QsRNA-seq的建库方法，该方法允许对长度仅相差20 nt的小于100 nt的片段进行凝胶自由分离。该方法允许使用分子标签进行定量，并且比基于凝胶的方法更易于自动化。通过观察秀丽隐杆线虫胚胎和幼虫中的miRNA，研究人员证明了QsRNA-seq可以得到非常准确、全面和可重复的结果。
A novel method for separating nucleic acids shorter than 100 nucleotides
sRNA测序和定量的难点在于其长度过短，为了将这些小RNA从tRNA等分离出来，需要开发一种能将20-100nt长度的分子分开的方法，为此研究人员改进了SPRI方法，该方法可以对特定片段范围的核酸进行筛选，通过核酸分子长度和凝聚剂的浓度可以分离不同长度的片段。当加入酒精时，可以使短至18 nt的片段与磁珠结合。因此研究人员假设通过调整异丙醇的浓度，就能实现分离小于100 nt的分子。这该假设基础上，研究人员制备了一系列基于SPRI的尺寸选择溶液，其中PEG浓度相同，异丙醇浓度范围则是32%-54.5%，然后测试它们促进不同长度的单链RNA寡核苷酸（19-66 nt）与磁珠的结合能力（相当于模拟从tRNA等分子中分离sRNA过程）。之后研究人员还检测了用这些条件分离37 nt和58 nt分子的可行性，分离过程中还进行了两步尺寸选择。首先是长一些的分子与磁珠结合，收集未结合的短片段分子，然后再加入第二批磁珠和异丙醇，调整条件使得短一些的分子全部与磁珠结合。如图1展示的即为不同异丙醇浓度下，两种片段分子分离的情况。最终研究人员得到的结论就是在异丙醇浓度合适的条件下，可以将两种长度差在20 nt的短核苷酸分子分开。
QsRNA-seq: a method for preparation of small RNA libraries
分离完小片段RNA，接下来需要进行sRNA建库，这里研究人员起了个名字叫QsRNA-seq（如图2）。大致方法是第一步3‘端加adapter，然后移除长的RNA，之后在短RNA的5’端加adapter，进行反转录和扩增等步骤。QsRNA-seq方法是基于传统的基于PAGE的方法，该方法的一个问题是产量低，因此研究人员利用两种方法（QsRNA-seq和基于PAGE的方法）进行小片段寡核苷酸建库，结果表明QsRNA-seq的产量比另一种方法高5倍，并且具有更高的技术重复性。
之后研究人员又从秀丽隐杆线虫胚胎中提取RNA，分别用QsRNA-seq方法和基于PAGE的方法进行3次技术重复建库，最后结果表明用QsRNA-seq方法建的文库质量与其他方法相比具有相当高的质量和更高的产量。并且sRNA建库过程中会出现偏差，通过比较在5‘端加入UMI和不加UMI的文库发现，加入UMI会显著降低偏好性。
QsRNA-seq can evaluate miRNA abundance and expression changes accurately
之后研究人员为了研究QsRNA-seq方法检测sRNA的能力，利用该方法从不同发育阶段野生线虫和人类大脑组织中提取RNA，建库测序后将测序reads比对到miRNA上。在秀丽隐杆线虫样本中，100%miRNA都被检测到至少呈现一条链（3p或者5p），稀有miRNA比如lsy-6也被检测到，并且RNA起始量降低也能得到一致的结果。在人类大脑中，可以比对上80%miRNA。研究人员认为这种差异可能是RNA提取样本不一样，线虫样本是从整个蠕虫中提取，而另一种样本只是来源于人类某一特定组织中的细胞。
为了进一步评估方法的一致性，研究人员分别从技术重复和生物学重复两方面评估miRNA表达水平的离散情况，结果表明加入UMI分子后，不管是技术重复还是生物学重复，都会降低文库偏差，展示出更低的离散水平（图3）。
The 23-nt-long small RNAs are enriched in L4 larvae and not in embryos in C. elegans
在秀丽隐杆线虫中除了22 nt的miRNA分子，还有各种内源性siRNA（26 nt,21 nt等）。为了评估QsRNA-seq方法是否能检测到所有的sRNA，研究人员计算了比对到基因组上的reads的长度分布，然后发现在胚胎期和L4幼虫期的秀丽隐杆线虫中reads长度分布有差别（图4），在胚胎期，大部分sRNA长度是22 nt，而L4阶段主要是23 nt。后续通过去除比对到miRNA的reads，重新计算长度分布，发现大部分22 nt，23 nt长的分子是miRNA。类似的分析发现21 nt的序列是21 U，26 nt的序列是初级siRNA。
为了进一步研究胚胎期和L4幼虫期的秀丽隐杆线虫中reads长度分布的差别，研究人员计算了在两个不同时期miRNA的表达变化情况，通过筛选差异表达miRNA，发现30个miRNAs主要在胚胎期表达，38个miRNAs主要在L4时期表达（图5a）。有趣的是只用23 nt长的序列评估miRNA的表达变化，研究人员发现23 nt的miRNA在L4期中表达比例更高（图5b）,而22 nt长的miRNA表达比例在不同发育时期没有显著差别，表明23 nt的miRNA可能是发育过程中特有的。
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