鲁达 HBV是一种嗜肝的DNA病毒，会引起人类急性或慢性肝炎。慢性乙型肝炎(CHB)是导致肝纤维化、肝硬化和肝癌的重要原因[1]。
1965年，Blumberg等[2]在澳大利亚土著人检测到HBsAg，称为“澳大利亚抗原”。1970年，Dane等[3]通过电镜检测到HBV完整的病毒颗粒，称为“丹氏颗粒”。HBV有严格的种属特异性，它的自然宿主限制在人类和非人灵长类动物身上，包括黑猩猩(chimpanzees)、大猩猩(gorillas)、长臂猿(gibbons)和猩猩(orangutans)。这些非人灵长类动物的研究，受到伦理和饲养等限制，只有很少的实验室有条件开展，并且黑猩猩在欧洲已被禁止用于实验研究[4]。直到2012年，李文辉团队[5]发现HBV感染肝细胞的关键受体，是钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(NTCP)；稳定表达人NTCP的HepG2细胞系(HepG2-NTCP，自然状态下HepG2不能感染HBV)可以感染HBV。2016年，Lempp等[6]发现，小鼠肝细胞转入人NTCP后可以支持HBV的进入，但不能转录、翻译和形成共价闭合环状DNA(cccDNA)。2017年，Lempp等[7]将食蟹猴、恒河猴和猪的肝细胞表达hNTCP，这些细胞变得HBV易感，效率与人肝细胞相当。以上研究表明，不同物种间的差异，如肝细胞的结构、微环境和(共)受体，或者血液中的可溶性因子，影响了HBV的易感性和感染效率。这也从侧面表明，HBV侵入、修复、cccDNA形成(非必须)、转录、复制、组装、释放、慢性感染和再复发机制的复杂性，特别是还未弄清楚造成物种间差异的原因，需要进行更深入的基础研究。
目前CHB抗病毒治疗通过口服核苷(酸)类似物(NUCs)可抑制HBV复制，安全性高，但很少发生HBsAg清除及血清学转换，停药无期；只能在不到10%的CHB患者中实现“功能性治愈”。皮下注射聚乙二醇干扰素α(PEG-IFNα)可使10%~30%的患者清除HBeAg，并发生HBsAg血清学转换，兼具免疫调节特性；但耐受性差，存在不良反应[8]。在研的抗HBV药物或者疗法分为两类：(1)抑制或者沉默病毒的复制，如HBV进入抑制剂、cccDNA及其转录活性抑制剂、基因表达抑制剂、核衣壳组装和pgRNA包装抑制剂、HBsAg分泌抑制剂、RNAi和Crispr/Cas技术敲除等；(2)激活或者诱导免疫反应，如免疫调节剂、干扰素、Toll样(病原体识别受体)受体激动剂、免疫检查点调节剂、治疗性疫苗和改造HBV特异性T淋巴细胞等[8-9]。理想的临床前动物模型既需要模型中有较高的HBV病毒含量，也需要相应的免疫环境。遗憾的是，至今还没有建立一个有效的模型，能够真实地再现HBV感染的免疫和发病机制。由于鸭子、土拨鼠和树鼩是非标准化的实验动物[4]，而hNTCP转基因的食蟹猴、恒河猴和猪等模型还没有成功的报道，本文主要综述小鼠HBV模型的最新进展(表 1)，为临床前HBV药效实验和HBV相关研究提供参考。
1HBV转基因小鼠模型
在HBV启动子或者小鼠肝细胞特异启动子(如白蛋白启动子Alb)的控制下，将编码HBV蛋白的基因序列通过原核注射转入到小鼠中，获得表达HBV蛋白的转基因小鼠，如病毒包膜(envelope，S基因)[10-12]、核心(core，C基因)[13]、前核心(precore，preC基因)[14]和X基因[15-16]。这些模型对HBV的特性验证提供了重要的数据支持。随后，有两个研究小组[17-18]用全长或者超长的HBV全基因序列制成转基因小鼠，然而仅在少数转基因小鼠的器官中检测到病毒复制和蛋白表达，其血清中病毒的滴度很低。
在乙型肝炎抗病毒药物筛选方面应用较多的转基因小鼠模型是Guidotti等[19]研发的，其在HBV全长序列5′末端重复一个C基因和X基因及其增强子，构建了1.3倍全长HBV基因组的转基因小鼠。该小鼠血清中可检测到HBsAg、HBeAg和HBcAg，在小鼠体内也检测到完整病毒颗粒的形成，且病毒颗粒具有感染性。该转基因小鼠肝脏和肾脏中有高水平的HBV表达，外周血清中的HBV DNA拷贝数高达107 IU/ml，其HBV抗原转录水平与CHB患者相当，已经成功用于HBV合成、转录，病毒组装和成熟的病毒分泌等抑制药物的药效实验[20-22]。然而，由于转基因模型中HBV整合在小鼠基因组上，是组成型表达(在胚胎期即表达)，因而对HBV有天然的免疫耐受性，不适宜于进行免疫病理学方面的研究。另外，HBV转基因小鼠中包含了rcDNA(relaxed circular DNA)合成、转录，病毒组装及成熟的病毒分泌，但未检测到cccDNA形成，尚不清楚不能形成cccDNA的原因[23]。
为了解决HBV抗原免疫耐受的问题，王军等[1]综述了不同的方案，比如用HBV转基因小鼠与免疫缺陷小鼠(如SCID、TCRα-/-，和RAG1-/-等)杂交，构建了免疫缺陷背景的HBV转基因小鼠。这些小鼠缺失T和B淋巴细胞，给该小鼠过继输入相同遗传背景的野生型小鼠脾脏细胞(T和B淋巴细胞)，使表达HBV的小鼠肝脏细胞暴露在重建的免疫系统中，得到了类似于人类的HBV感染模型，但其操作过程比较复杂，且与人类感染HBV后引起肝脏炎症的自然病程相比仍有较大差别，表明鼠肝脏中存在与人肝脏细胞不同的特征，如存在不易感HBV的微环境或者结构等。另一种解决HBV抗原免疫耐受问题的方法是通过基因表达调控系统，如Tet-on系统，在特定的时间及部位(肝脏)诱导HBV基因表达，但该类模型同样存在肝炎特征与人类肝炎差别较大的问题。
2HDI小鼠模型
利用瞬态水动力机械地(高压)将HBV DNA挤入肝细胞，可以导致短暂的HBV复制以及蛋白质合成。2002年，Yang等[24]首次建立了HBV水动力注射小鼠模型。在小鼠尾部静脉，通过注入大量生理盐水，相当于小鼠体质量的8%~10%，其中含有1.3倍HBV基因组DNA的质粒，在很短的时间内(5~8 s)注射到小鼠静脉内。但是随着小鼠体内HBV特异性抗体和细胞毒性T淋巴细胞的出现，血液中的HBV抗原通常在第7天消失；而肝脏HBV转录物在转染后第15天被清除，与抗病毒抗体和抗病毒CD8+T淋巴细胞的出现相吻合。在NOD/SCID小鼠中缺乏功能性T和B淋巴细胞、HBV基因表达和复制可以持续超过81天，表明宿主的免疫反应，特别是病毒特异性CTL反应可能在抗HBV中起重要作用。
HDI小鼠模型是一种方便、可行的方法，直接用于不同基因型、变异或突变的HBV模型构建。而且HBV基因组没有整合到宿主基因组中，为研究HBV免疫反应和发病机制提供了可能。然而，水动力注射程序导致严重的肝损伤，使实验结果的解释复杂化，尤其是在免疫反应和发病原因方面造成混淆[25]。另外，低的转染效率(5%~10%)和持续时间短也限制了该模型的使用[26-27]。另外，小鼠的遗传背景、年龄、性别和免疫系统状态等也会影响HDI小鼠模型中HBV在体内的持久性[24, 28]。
3AAV-HBV转染小鼠模型
2001年，Sprinzl等[29]开发了腺病毒载体携带1.3倍的鸭HBV基因组(Ad-DHBV)，经尾静脉注射进入小鼠体内的方法。采用类似的方法，von Freyend等[30]将含有1.3倍HBV基因组的腺病毒载体(Ad-HBV)注射到C57BL/6小鼠体内，在小鼠肝脏中检测到3个月以上的HBV转录产物。由于腺病毒载体很大，同时编码一些非HBV病毒产物，这些产物也可能诱导免疫反应来清除HBV[31]。
肝细胞靶向AAV载体具有低免疫原性的特点，将AAV-HBV通过小鼠尾静脉注射，成功建立了AAV-HBV小鼠模型[32-33]。这类模型可以持续产生HBV病毒颗粒和HBV抗原且1年以上无血清转化，重现了临床CHB患者的部分免疫学特征。因而，AAV-HBV模型也被用于评估新的基于免疫的疗法和抗病毒治疗[34]。目前常用的rAAV8-1.3HBV病毒载体，经尾静脉注射到野生C57BL/6小鼠体内，其表达水平随重组病毒注射剂量的增加而升高，高剂量注射时可造成超过40%的肝细胞感染HBV，血清中HBV DNA可达105 IU/ml。但要注意不同小鼠品系HBV感染的表型存在差别。
2017年Lucifora等[35]报道通过Southern印迹分析可检测到AAV-HBV中存在cccDNA，然而这些cccDNA，是不是通过小鼠肝细胞中的rcDNA前体产生的仍不清楚，目前也无新的研究报道。另外在这些模型中，HBV的复制不是由cccDNA直接驱动的，而且重组AAV基因组进入体内后，一部分可以形成大的多聚体并整合到宿主基因组中，从而使得这些模型与cccDNA的相关性降低[36]。尽管如此，AAV-HBV模型仍是用于评估免疫疗法和抗病毒治疗的主要模型。
4cccDNA替代小鼠模型
HBV感染的人肝脏细胞中含有3.2 kb松弛环状rcDNA，在细胞核中，rcDNA修复为cccDNA是病毒转录复制的起始模板。cccDNA转录的病毒前基因组RNA(pregenomic RNA，pgRNA)在细胞质内包装入核衣壳，通过反转录起始病毒DNA合成，成熟的病毒核衣壳颗粒再次转运至细胞核，完成细胞内的病毒复制周期。HBV基因组高度压缩，难以容纳外源性序列[37]。已经开发了多种途径，通过体外重组生产cccDNA(rcccDNA)[38]，rcccDNA与野生病毒cccDNA具有较大相似性，能够在细胞内或体外系统大量诱导产生，是HBV研究的一类重要工具。
2014年Qi等[39]开发了一种基于HDI的重组cccDNA小鼠模型，通过Cre/loxP介导的DNA重组在体内生成cccDNA。在HBV基因组两侧引入同向LoxP位点，由重组酶Cre引发LoxP位点之间的DNA重组和环化，生成含有单拷贝LoxP位点的rcccDNA；LoxP位点则位于一段约90 bp的外源性内含子中(HBsAg基因近5′端)，可在RNA转录过程中移除，实现所谓的无缝插入。然而，该模型中病毒复制水平较低，体内持续时间较短，可能是由于转染细胞中Cre依赖性重组酶激活了免疫系统。另外两个含DNA的细菌质粒共转染，重组效率低，导致cccDNA转染肝细胞非常低。传统的含有DNA的细菌质粒，导致体内转基因的快速转录沉默，即使载体DNA仍然保留在细胞中。Kay等[40]开发了一种PhiC31整合酶介导的分子内重组技术，以制备无细菌主链的微型环载体DNA，可在体外和体内表达高水平的转基因。基于大肠杆菌PhiC31重组酶诱导表达系统，建立了一种体外诱导rcccDNA attR微环产生和纯化的策略，纯化的rcccDNA attR微环具超螺旋结构，能够支持功能性的HBV复制和抗原表达。由于rcccDNA编码中包含外源内含子序列，应用引物特异性PCR方法易于与HBV DNA复制中间体及从头合成的新生cccDNA区分。最近，在采用复制缺陷腺病毒载体将rcccDNA转入肝脏特异的Cre小鼠中检测到HBV的时间超过62周[41]。在小鼠肝脏中，观察到了持续坏死性炎症反应、纤维化和肝硬化等病理学特征，与临床慢性肝炎相似。Yan等[42]发表的文章中，将39 bp的attR位点设计插入在HBV多聚酶基因的spacer区(PreS1起始密码子前)，显示并不影响病毒复制。通过免疫正常的小鼠尾静脉HDI注射rcccDNA，可短期诱导HBV抗原血症(平均5~7周)，与急性HBV感染相似。他们比较了C3H/HeN、FVB/N和CBA/J三种小鼠，其中C3H/HeN小鼠感染率最高，半数以上小鼠体内HBV复制持续1年以上。cccDNA替代模型可用于研究慢性病的免疫反应和发病机制，这也有助于评估cccDNA靶向抗病毒药物策略。然而，由于这类模型仍是小鼠的肝脏细胞，不涉及HBV的入侵、扩散和再传染的过程，仍不能替代人鼠嵌合肝脏人源化小鼠模型。
5人鼠嵌合肝脏小鼠模型
通过小鼠的脾脏异种移植人原代肝细胞(PHH)，可以整合到免疫缺陷的肝损伤小鼠的肝实质中。这样获得的人鼠嵌合肝脏小鼠可以更好的模拟HBV自然感染和cccDNA复制过程。目前，文献报道或商品化的主要有5种人源化肝脏小鼠模型(表 2)。
5.1 uPA-SCID小鼠
尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)在细胞外基质的降解过程中发挥重要作用。uPA系统包括uPA、uPA受体和它的2种抑制剂——纤维蛋白溶酶原激活质抑制物PAI-1和PAI-2。纤溶酶通过直接或间接激活基质金属蛋白酶(MMP)来降解细胞外基质和层黏连蛋白、纤维连接蛋白、纤维蛋白聚糖、Ⅳ型胶原等基膜成分。uPA参与多种生理和病理过程，在肝脏再生过程中uPA通过激活纤溶酶清除坏死的细胞，并且能够降解胞外基质促进肝小叶结构的重建。早在1991年Sandgren等[43]就做出了Alb-uPA转基因小鼠，由于uPA的肝毒性，Alb-uPA小鼠在出生4天就会出现出血症状。2000年Weglarz等[44]作了改进，制作了MUP-uPA转基因小鼠，使用MUP增强子/启动子在肝细胞中特异性表达uPA，用来研究肝细胞移植。与Alb-uPA类似，由于基因丢失，uPA的表达会逐渐降低；不同的是MUP-uPA小鼠要到2~4周之后才会开始表达uPA，从而降低新生小鼠的病死率。MUP-uPA小鼠的人源化肝脏重建水平比较低。2004年，Tateno等[45]报道了uPA-SCID小鼠，可以高水平人源化重建小鼠肝脏。uPA-SCID小鼠需要在出生后2周内重建肝脏，繁殖比较困难，属于不能调控的肝损伤模型。
5.2 FRG小鼠
2007年，Azuma等[46]报道了FRG小鼠，即将延胡索乙酰乙酸水解酶基因(Fah)敲除小鼠回交到Rag2-/- &Il2rg-/-敲除的高度免疫缺陷背景，可以实现高水平的人源化重建。小鼠Fah基因敲除后，酪氨酸在体内代谢障碍，造成延胡索乙酰乙酸(FAA)积累，从而引起肝细胞的损伤。NTBC是4-羟基苯丙酮酸双加氧酶的抑制剂，可以阻止FAA的积累，服用NTBC可以有效地改善酪氨酸血症的症状。FRG小鼠繁育时喂饲低酪氨酸日粮或者饮水补充NTBC。若需要肝损伤重建时，可以逐步撤去NTBC，属于可调控肝损伤模型。
5.3 TK-NOG小鼠
TK-NOG小鼠是另一种诱导性肝损伤模型，由白蛋白启动子驱动单纯疱疹病毒肝特异性表达病毒1型胸苷激酶(HSVtk)，然后回交到NOD/Shi scid小鼠背景[47]。因为阳性雄鼠不育，这个模型扩繁困难。
5.4 AFC8小鼠
2011年，Washburn等[48]报道了一种在Alb启动子之后表达融合蛋白FK506结合蛋白(FKBP)和caspase8的转基因小鼠(AFC8)，该小鼠模型受到AP20187(一种二聚体FKBP)选择性调控，然后通过回交的方式获得了Balb/C Rag2-/-&Il2rg-/-背景的AFC8小鼠。这个模型的人源化肝重建水平比较低(约30%)。
5.5 URGⓇ小鼠
该模型是国内最早的人源化肝脏小鼠模型。URG小鼠由4种基因修饰动物模型交配获得，包含2个转基因和2个基因敲除。其核心模型源于2009年Song等[49]构建了TRE-uPA转基因小鼠和Alb-rtTA转基因小鼠，然后交配获得了Alb-rtTA/TRE-uPA双阳性小鼠；通过Dox诱导，在该小鼠中检测到uPA表达和肝损伤。北京维通达生物技术有限公司的研发人员将Alb-rtTA/TRE-uPA双阳性小鼠连续8代回交到NRG(NOD背景Rag2/ Il2rg小鼠)背景，2012年获得Alb-rtTA/ TRE-uPA/Rag2/Il2rg小鼠。作为新一代的可调控肝损伤人源化肝脏小鼠模型，人源肝脏细胞可以实现高达95%整肝重建，满足HBV药物的药效、药代和药动等相关实验需要。使用该模型，也发表了一系列高水平研究论文[50-53]。
宿主免疫应答在HBV感染中起着至关重要的作用，然而上面5种人鼠嵌合肝脏小鼠，均为高度免疫缺陷背景，无法直接用于HBV特定的免疫和炎性反应研究。Washburn等[48]开发了一种人源化小鼠模型(AFC8-hu-HSC/Hep小鼠)，共移植人CD34+造血干细胞(HSC)与肝细胞祖细胞进入新生(出生后第1周内)的转基因小鼠，同时具有人类免疫系统和人的肝细胞。但是这个模型人肝细胞重建水平低，也未检测到抗原特异性B淋巴细胞和T淋巴细胞反应。2014年，这个小组建立了A2/NSG/Fas hu-HSC/Hep双人源化小鼠模型(人HLA-A2转基因的NSG小鼠)，人HLA-A2转基因促进人MHC限制性T淋巴细胞的发育；小鼠特异性抗Fas激动剂治疗抗体(JO2)支持人体免疫细胞和肝细胞的再增殖[54]。A2/NSG/Fas hu-HSC/Hep小鼠可支持持续性HBV感染(＞4个月)与HBV特异性人类免疫有关的肝纤维化；而且在HBV感染的嵌合肝脏中，观察到活化的人M2样巨噬细胞聚集，这与HBV引起的急性和慢性感染相似。但是，该模型移植的细胞来源于流产胎儿组织，存在伦理问题的限制。2015年, Strick-Marchand等[55]报道，使用BRGS-uPA小鼠(BALB/c Rag2-/- &Il2rg-/- NOD.sirpa uPAtg/wt) 实现了更高水平的双人源化重建。在BRGS-uPA小鼠出生后(＜1周龄)辐照并移植CD34+造血干细胞重建人源性免疫系统；在4~8周时移植成年人肝细胞重建肝脏。嵌合肝脏重建水平可以达到20%~50%，且在嵌合肝脏中检测到了多种免疫细胞亚群，可以检测到幼稚的T淋巴细胞(CD45RA+)和成熟的B淋巴细胞，以及人源的Igs抗体。尽管人类HSC和人肝细胞的HLA不匹配，但未观察到任何移植物排斥反应。由于肝细胞移植是在HSC注射后4~8周内进行，即在成熟T淋巴细胞出现在外周器官之前，研究人员推测肝细胞产生的同种异体抗原，呈现给发育中的胸腺细胞，使其具有耐受性；另一个解释是肝脏微环境的耐受性，肝内抗原呈递细胞可以将免疫应答向免疫调节表型倾斜，从而保护肝细胞免受免疫攻击。在HBV肝细胞感染期间，免疫反应在介导病毒根除或持续存在中起着重要作用。这种新型的双人源化模型可能是研究单感染和共感染免疫反应的一个合适的平台，可以应用于测试新的治疗策略或候选疫苗。2019年Yuan等[56]使用FRGS小鼠(Fah-/-Rag2-/-IL-2R-/-SCID)移植了人类骨髓间充质干细胞(hBMSCs)，可以转分化为双人源化小鼠模型(hBMSC-FRGS)，但重建水平比较低。尽管肝脏和免疫双人源化小鼠模型理论上是完美的模型，目前仍受到生产困难、高成本和一系列伦理等因素限制。
6小结
不清楚造成HBV严格种属特异性的原因，因而HBV动物模型都存在各自的优势和不足。尽管如此，这些模型可以部分模拟HBV感染患者的特征，合理的选择这些模型，将有助于加快药筛进程、验证新疗法和更快解决HBV生物学发病机制等方面的问题。由于HBV发病机制的复杂性，已经有研究表明，宿主因素影响HBV的感染。如许多基因(如HLA和IL-4)的遗传多态性会影响抗原呈递或细胞因子的产生，从而影响抗体的产生，导致对疫苗接种的反应程度不同。NTCP的多态性可能决定HBV进入的过程。宿主因素也可能影响先天性和适应性免疫，包括巨噬细胞的激活和吞噬、APCs的抗原呈递以及HBV特异性T淋巴细胞的启动和功能，从而影响HBV的清除和持续性。人类相关基因的遗传多态性可以直接或间接地决定这些免疫功能。例如，目前的人源化NTCP转基因或者定点敲入KI模型，只能实现HDV的瞬时感染，不能实现HBV的感染。如果，通过人源化导入HBV的受体和HBV关键易感基因，实现小鼠肝细胞对HBV的易感性并产生cccDNA，必将促进HBV小鼠模型临床前模型质的飞跃。相信随着研究的进一步突破，将会有更理想的HBV临床前模型出现，为最终治愈乙型肝炎提供帮助。
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引证本文
杨炜峰, 苗振川, 宋希军, 等. HBV感染的动物模型研究进展[J]. 临床肝胆病杂志, 2021, 37(5): 999-1005.
本文编辑：刘晓红
公众号编辑：邢翔宇
述评｜张晓东：抗HBV新药展望
全网首发｜《临床肝胆病杂志》2021年第5期“抗HBV新药研发与临床研究进展”重点号（执行主编：张晓东）