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1864年6月5日(或日本的旧历)，一群长洲版的后进派武士来到京都，在一个叫池田屋的旅馆秘密集会上，想在京都工作，这一情报被新船船队拦截，当天晚上全部出动，第一次到达池田家，抓住他们并杀死他们。
看到这里很多人可能会觉得新选组只是对敌人狠，也许内部一团和气，如果这么想那就大错特错了。在近藤、土方肃清芹泽势力、确定领导地位后不久，土方就亲自制定了新选组成员须遵从的一系列纪律规范，称“局中法度”，如果违背将受到切腹的惩罚，其中最具代表的两条是“不可违背武士道”、“不可擅自脱离组织”，非常严苛，土方也因此被称为“鬼副长”，之所以制定这些魔鬼队规本质上还是为了维护权威和打击异己。据不完全统计，因违背法度而受到切腹惩处的新选组骨干以及队员有40多人，他们基本上都是犯了那两条规定。在这些内部整肃中，最狠的一次当属1867年3月的“油小路事件”。
当时新选组参谋（相当于军队的参谋长）伊东甲子太郎等一批人决定离开新选组单干，近藤、土方表面上欢送他们，心中已经决定弄死他们了。不久后一个夜晚，一群埋伏的新选组队员在伊东在回家的必经之路——油小路大街当场砍死伊东，这还不算，他们又以伊东的尸体为饵，把伊东手下的人引过来剿杀，本次街头火并就是“油小路事件”，场面的惨烈程度堪比之前的“池田屋事件”，不过这次对付的却是曾经的队友。尽管伊东等人的离队不算“擅自脱离组织”，但在近藤、土方眼中却等于背叛组织，只有死路一条。
然而“花无百日红”，1868年倒幕军与幕府正式开战，新选组自然跟着会津藩站在幕府一边，然而幕府的军队太不给力，被打得节节败退，新选组的日子也不好过，队员们死的死、散的散，“局中法度”也失去了效用，最后搞得连近藤都给倒幕军抓住，虽然被砍了脑袋，但近藤这一生还真没白活。
近藤死了，会津藩也指望不住，于是土方带着新选组残部跟随其他幕府残军撤到北海道，在那边成立了一个虾夷共和国，土方担任陆军奉行并（陆军副部长）一职，没多久就在与敌军作战时中流弹死了，讽刺的是土方前脚刚死，虾夷共和国后脚就举了白旗，而随着虾夷共和国的投降，新选组也彻底宣告解散。
在我们看来，新选组是一个旧社会的反动组织，而且新选组的活动地方仅限于京都，放在咱们国家估计连国民党军统的影响力都比不上。但根据日本人独有的审美观，新选组则是一群处于时代终结、极具武士道精神的“悲剧英雄”，如同绚烂时凋零的樱花一般，对于这种“悲剧英雄”应当给予更多的赞美而非贬斥，再加上司马辽太郎的著作《燃烧吧！剑》以及《银魂》、《薄樱鬼》等漫画的大力正面宣传，如今在日本人眼里，新选组就像金庸笔下的武侠人物一样。